Masarykovo nádraží vzniklo jako konečná stanice dráhy z Olomouce do Prahy; tato trať byla součástí významného spojení Vídně s Prahou. Jeho význam ještě vzrostl v roce 1850 po otevření železnice do Lovosic, Drážďan a Berlína. Třetí železniční trať, která byla na nádraží dovedena, tzv. pražská spojovací dráha, je v roce 1872 propojila přes dnešní Hlavní nádraží se Smíchovem.

Nádraží postavilo konsorcium společností Vojtěcha Lanny a bratří Kleinů v letech 1844 až 1845. Polohu nádraží a kolejiště navrhl Jan Perner, budovy architekt Antonín Jüngling. Empírová architektura nádraží s prvky novorenesance a klasicismu se více méně dochovala v nezměněné podobě dodnes.

Nádraží je jediným neprůjezdným (hlavovým) osobním nádražím v Praze (je nutné přepřahat některé lokomotivy) a původně bylo rozděleno pražskými hradbami na městskou část pro osobní a nákladní dopravu a mimopražskou část pro odstavování vozidel a manipulaci, což změnily pozdější přestavby.